INTRODUCTION

La rápida propagación de la actual pandemia del coronavirus (COVID-19) está amenazando la salud global, debilitando las economías del mundo y desafiando la prosperidad de las generaciones futuras (Chakraborty 2020). Durante la primera mitad del 2020, el COVID-19 ha afectado a más de 16 millones de personas y ha causado más de 660.000 muertes en todo el mundo (https://covid19.who.int/).

Al secuenciar todo el genoma de un virus a partir de muestras de pacientes (Zhu 2020) fue identificado  un nuevo Síndrome Respiratorio Agudo Severo Coronavirus-2 (SARS-CoV-2) y la enfermedad causada por este virus se denominó enfermedad del coronavirus 2019 (COVID-19).

Otro paso importante para frenar la propagación de esta pandemia fue la identificación de la vía por la cual el SARS-CoV-2 infecta las células del cuerpo humano. Los coronavirus se unen primero a receptores específicos en la superficie de las células. Posteriormente, ingresan a las células y se transportan a través de vesículas de transporte (endosomas), y finalmente llegan al núcleo celular (núcleo) donde su material genético se incorpora al ADN de las células del cuerpo humano (Li 2016).

De particular importancia es el primer paso de la vía infecciosa, a saber, la unión del virus al receptor en la superficie celular (Figura 1). Por parte del coronavirus, este mecanismo de unión involucra proteínas de pico específicas ancladas en la superficie del virus que contiene un dominio de unión al receptor (RBD) que reconoce específicamente su ‘sitio de acoplamiento’, un receptor específico en la superficie de las células del cuerpo. Este receptor, llamado enzima convertidora de angiotensina 2 (ACE2), es una proteína de membrana integral presente en muchas células en todo el cuerpo humano con su fuerte expresión en el corazón, sistema vascular, sistema gastrointestinal y riñones, así como en las células alveolares tipo II de los pulmones. (Li 2003, Hofmann 2005).

El dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína llamada Spike del SARS-CoV-2 se une al receptor ACE2 humano. Este mecanismo de unión es un determinante importante de la infectividad viral y el desarrollo del COVID-19.

Además, también es un objetivo importante para el desarrollo de vacunas y otras terapias (Du 2009, Du 2017).
Si bien la búsqueda de tales fármacos  y vacunas intervencionistas está en curso, existe una forma mucho más directa, y sobre todo más segura, de prevenir esta fatídica interacción de los coronavirus con el receptor ACE2: suprimir la expresión de los receptores ACE2 en las células del cuerpo humano para que ya no estén  disponibles para el anclaje del coronavirus.

En un estudio pionero reciente, pudimos demostrar que una composición específica de micronutrientes que contienen vitamina C, ciertos minerales, aminoácidos y extractos de plantas fue eficaz para disminuir significativamente la expresión celular de ACE2 en tipos de células claves a las que ataca el virus: células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas (alveolares) y células endoteliales de vasos sanguíneos humanos (vasculares). Estos micronutrientes fueron particularmente efectivos para regular a la baja la expresión del receptor ACE2 en condiciones inflamatorias, que están asociadas con el
coronavirus y otras infecciones (Ivanov 2020).

Los notables resultados de este estudio provocaron la pregunta de si los micronutrientes también pueden afectar otros mecanismos esenciales para las infecciones por coronavirus, a saber, la unión entre el virus y el receptor ACE2. Por lo tanto, nuestro objetivo era bloquear la entrada del virus en las células humanas, el mismo mecanismo de enfermedad que fue seleccionado esencialmente por todos los enfoques actuales basados en vacunas.

Si los resultados de este estudio fueran positivos, la humanidad dispondría de un enfoque nuevo, natural y seguro para controlar eficazmente la pandemia actual.
Por lo tanto, en el estudio actual probamos la eficacia de otra composición de nutrientes, que contiene polifenoles y componentes vegetales, en ambos aspectos claves de la infectividad del SARS-CoV-2: bloquear la expresión del receptor celular ACE2 y, al mismo tiempo, bloquear la unión. de una proteína Spike específica del SARS-CoV-2 al receptor ACE2 en células humanas.

MATERIAL Y MÉTODOS

Cultivos celulares

Se cultivaron células epiteliales humanas de las vías respiratorias pequeñas (células epiteliales alveolares, células epiteliales de las vías respiratorias pequeñas, SAEC) de ATCC (American Type Culture Collection) en un medio de crecimiento (ATCC) en matraces de plástico a 37ºC y 5% de CO2. Para el experimento, se colocaron los pases 5-7 de SAEC en placas de plástico de 96 pocillos tratadas con colágeno (Corning) en 100 µl de medio de crecimiento y se cultivaron para formar una capa de células confluentes durante 4-7 días.

Composición de micronutrientes

La combinación de micronutrientes utilizada en nuestros experimentos fue  desarrollada en el Instituto de Investigación del Dr. Rath (San José, CA). La formulación de la prueba contenía: quercetina – 400 mg, extracto de planta crucífera 400 mg, extracto de raíz de cúrcuma 300 mg, extracto de té verde (80% polifenoles) 300 mg y resveratrol 50 mg.

Suplementación celular

La mezcla disuelta en HCl 0,1 N según el protocolo de la Farmacopea de Estados Unidos (USP 2040) se denominó solución madre.

Para los experimentos de expresión de ACE2, las células SAEC se suplementaron con las dosis indicadas de la formulación en medio de crecimiento celular de 100 µl / por pocillos  durante 3 a 7 días. Las concentraciones de nutrientes aplicadas se expresaron en μg / mL.

Ensayo ACE-2 ELISA

Los pocillos de la placa de cultivo se lavaron dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se fijaron con una solución de formaldehído al 3% / Triton X100 / PBS al 0,5% durante 1 hora a 4ºC, luego se lavaron cuatro veces con PBS.

Posteriormente, se agregaron 200 μl de albúmina de suero bovino al 1% (BSA, Sigma) en PBS y la placa se incubó a 4 ° C durante la noche. Se añadieron anticuerpos policlonales anti ACE2 de conejo (Sigma) a 100 µl de BSA al 1% / PBS durante 1,5 h de incubación a temperatura ambiente (TA). Después de tres ciclos de lavado con BSA al 0,1% / PBS, los pocillos se suministraron con 100 µl de anticuerpos policlonales anti ACE2 de conejo (Sigma) conjugados con peroxidasa de rábano picante (HRP, Sigma) durante 1 hora a TA. Después de tres ciclos de lavado con 0.1% BSA / PBS, se determinó la actividad de HRP retenida mediante incubación con 100 μl de solución de sustrato TMB (Sigma) durante 20 minutos a temperatura ambiente, seguido de la adición de 50 μl de H2SO4 1N y se realizó la medición de la densidad óptica a 450 nm con lector de microplacas (Dispositivo molecular).

Los resultados se expresan como un porcentaje del control experimental sin adición (media +/- DE, n = 6). El valor medio del control no específico (pocillos incubados sin anticuerpos anti ACE2)  (n = 6) se restó de todos los valores de la muestra.

Bloqueo de RBD (dominio de unión al receptor)

Este ensayo se realizó utilizando un kit de prueba de neutralización de virus sustituto GenScript SARS-CoV-2 que puede detectar anticuerpos o inhibidores que bloquean la interacción entre el dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína de Skipe viral y el receptor de superficie celular ACE2.
Todas las muestras de prueba con las concentraciones indicadas y los controles positivos y negativos (proporcionados por el fabricante) se diluyeron con el tampón de dilución de muestras en  una relación  de volumen de 1: 9.

En tubos separados, el RBD conjugado con HRP también se diluyó con el tampón de dilución de HRP en una relación  de volumen de 1:99.

La reacción de unión / neutralización se realizó de acuerdo con el protocolo del fabricante. Brevemente, los controles positivos y negativos diluidos, así como las muestras de prueba con las concentraciones indicadas, se mezclaron con la solución de HRP-RBD diluida con una relación de volumen de 1: 1 y se incubaron durante 30 minutos a 37ºC.

A continuación, se añadieron 100 µl de cada mezcla de control positivo, mezcla de control negativo y las mezclas de muestra de ensayo a los pocillos correspondientes con receptor ACE2 inmovilizado y se incubaron durante 15 minutos a 37ºC. Posteriormente, las placas se lavaron cuatro veces con 260 µl / pocillo de la solución de lavado 1x y se añadió solución de TMB a cada pocillo (100 µl / pocillo). Las placas se incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente durante hasta 5 minutos. Luego se agregaron 50 µl / pocillo de la solución madre para debilitar la reacción y se midió inmediatamente la absorbancia en el lector de placas a 450 nm. El experimento se llevó a cabo tres veces por duplicado. Los valores se dan en% del control.

Figura 1:

A. Los coronavirus infectan las células del cuerpo humano a través del receptor ACE2.
B. Principio del kit de prueba de investigación disponible comercialmente que se usa en este estudio para medir la interacción entre la proteína de unión al receptor (RBD) del coronavirus SARS-CoV-2 y el receptor ACE2 en la superficie celular.

RESULTADOS

Eficacia de una combinación específica de micronutrientes en la expresión de ACE2 en células epiteliales alveolares pequeñas humanas.

La Figura 1 muestra los efectos de diferentes concentraciones de una combinación específica de diversos componentes y extractos vegetales activos sobre la expresión celular de los receptores ACE2 en células epiteliales alveolares pequeñas humanas.

Figura 2: Efectos de la combinación de micronutrientes sobre la expresión del receptor ACE2 en células pulmonares humanas (pequeñas células epiteliales alveolares). Los cambios en la expresión de ACE2 se presentan como % del control.

Los resultados indican una disminución dependiente de la concentración en la expresión del receptor ACE2 según lo evaluado por la unión de un anticuerpo específico. A la concentración más alta de 320 ug / mL de nutrientes, la expresión de los receptores ACE2 celulares disminuyó en un 92%. Esto indica que en presencia de estos micronutrientes, la unión viral a estos receptores puede reducirse sustancialmente.

Figura 2: Efectos de la combinación de micronutrientes sobre la expresión del receptor ACE2 en células epiteliales alveolares pequeñas humanas. Los cambios en la expresión de ACE2 se presentan como% del control.

El efecto de la combinación específica de micronutrientes sobre la unión de RBD al receptor ACE2.

La interacción del sitio de unión del virus (secuencia RBD de la proteína Spike del SARS-CoV-2) con su receptor celular es el paso necesario para que el virus penetre en las células del cuerpo y un requisito previo para la infección.

Examinamos la capacidad de la combinación descrita de sustancias vegetales activas para inhibir esta interacción entre el sitio de unión de la proteína Spike del SARS-CoV-2 y el receptor ACE2 humano. En nuestro estudio, utilizamos un sistema de prueba altamente sensible que se basó en los últimos hallazgos científicos. Con la ayuda de este sistema, se pueden detectar moléculas que pueden bloquear la interacción del dominio de unión al receptor (RBD) de la proteína Spike que se encuentra en la superficie  del virus con el receptor ACE2 de la célula.

Fig 3. Bloqueo de la unión del Spike (S) de SARS-CoV-2 (RDB) al receptor ACE2 mediante una combinación de micronutrientes específica en % de control.

La Figura 3 muestra que la combinación de prueba de compuestos derivados de plantas naturales fue capaz de bloquear la unión del dominio RBD en la proteína Spike del virus SARS-CoV-2 a su receptor ACE2.  Este efecto inhibidor dependía de la concentración y a una concentración de 100 µg / ml de la mezcla, provocó una inhibición de la unión de un 97%.

Su fuerte eficacia en la prevención de la unión viral ya había sido demostrada, con  una concentración 40 veces menor, es decir  2,5 µg / ml, lo que provocó una inhibición de la unión de aproximadamente un 20%.

DISCUSIÓN

Importancia de nuestros hallazgos

Los resultados presentados en este estudio documentan que los micronutrientes pueden inhibir fuertemente importantes mecanismos celulares asociados con la infección por coronavirus.
Estos datos están disponibles en un momento crucial en el que la comunidad científica y médica mundial está buscando desesperadamente soluciones efectivas para la pandemia del COVID-19.

Mediante la aplicación de metodologías científicas y técnicas de vanguardia utilizadas en la investigación del coronavirus, hemos demostrado que los micronutrientes pueden inhibir la interacción del sitio de unión del RBD en la proteína Spike del SARS-CoV-2 a su receptor específico ACE2 en un 97%.

Esto significa que los micronutrientes podrían prevenir casi por completo el riesgo de infección viral. Además, la misma composición de micronutrientes inhibió la expresión de los receptores ACE2 en pequeñas células epiteliales alveolares humanas hasta en un 92%.

Anteriormente, también informamos que otra combinación de compuestos naturales que incluyen vitamina C, aminoácidos, componentes vegetales y minerales pudieron disminuir significativamente la expresión de los receptores ACE2 en dos tipos de células principalmente atacadas por el coronavirus: las del epitelio pulmonar humano y las células endoteliales vasculares humanas. (Ivanov 2020).

Otro hallazgo importante de ese estudio fue que la inhibición de la expresión de los receptores ACE2 fue aún más pronunciada en condiciones proinflamatorias que acompañan a cualquier infección viral. E

Esto significa que la efectividad de los micronutrientes es aún más pronunciada en condiciones clínicas y en estadios avanzados de COVID-19, que se caracterizan por una inflamación generalizada y una llamada «tormenta de citoquinas».

REFERENCIAS

1. Chakraborty I, Maity COVID-19 outbreak: Migration, effects on society, global environment and prevention. Sci Total Environ. 2020; 728: 138882. https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.scitotenv.2020.138882
2. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/. Updated August 13, Accessed August 14, 2020.
3. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382(8): 727-733. doi: 1056/NEJMoa2001017
4. Li Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu. Rev. Virol. 2016; 3(1): 237-261. doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301
5. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin- converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426(6965): 450–454. https://doi.org/10.1038/nature02145
6. Hofmann H, Pyrc K, van der Hoek L, Geier M, Berkhout B, Pohlmann S. Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(22):7988– 7993. https://doi.org/10.1073/pnas.0409465102
7. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang S. The Spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7, 226–236. https://doi.org/10.1038/nrmicro2090
8. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang. MERS-CoV Spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21(2): 131-143. doi:10.1080/14728222.2017.1271415
9. Ivanov V, Ivanova S, Niedzwiecki A, Rath M. Effective and save global public health strategy to fight the COVID-19 pandemic: Specific micronutrient combination inhibits Coronavirus cell-entry receptor (ACE2) expression. J Cell Med & Nat. Health, 2020.
10. Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
11. Jariwalla R, Gangapurkar B, Pandit A, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Micronutrient Cooperation in Suppression of HIV Production in Chronically and Latently Infected Cells. Mol Med 2010; 3(3): 377-85. doi: 10.3892/mmr_00000268.
12. Deryabin PG, Lvov DK, Botikov AG, et al. Effects of a nutrient mixture on infectious properties of the highly pathogenic strain of avian influenza virus A/H5N1. Biofactors. 2008; 33(2): 85-97. doi: 10.1002/biof.5520330201.
13. Barbour EK, Rayya EG, Shaib H, et al. Alleviation of histopathological effects of avian influenza  virus by a specific nutrient synergy. International J Appl Res Vet Med. 2007; 5(1): 9-16.