INTRODUCERE

Răspândirea rapidă a actualeo epidemii de coronavirus (COVID-19) ameninţă sănătatea globală destabilizând economiile lumii şi provocând prosperitatea generaţiilor viitoare. (Chakraborty 2020).În decursul primei jumătăţi a anului 2020, COVID-19 a afectat peste 16 milioane de oameni şi a cauzat peste 660.000 de decese în întreaga lume(https://covid19.who.int/).

Prin segmentarea întregului genom al unui virus din mostre de la pacienţi, a fost identificat un nou coronavirus-2 al Sindromului Acut Respirator Sever (SARS-CoV-2) iar boala cauzată de acesta a fost numită boala coronavirusului 2019 (COVID-19).

Un alt pas important către limitarea răspândirii acestei pandemii a fost identificarea căii prin care SARS-CoV-2 infectează celulele organismului uman. Coronavirusurile se leagă mai întâi de receptori specifici de la suprafaţa celulelor. Ulterior, aceştia intră în celule şi sunt transportaţi cu vehicule de transport (endozomi) ajungând în final în centrul celulei (nucleu) unde materialul lor genetic este încorporat în ADN-ul celulelor umane(Li 2016).

O deosebită importanţă o are primul pas pe calea infectării şi anume legarea virusului de receptorul de la suprafaţa celulei (Figura 1). Din partea coronavirusului, acest mecanism de legare implică proteine specifice cu aspect de ţepi ancorate pe suprafaţa virusului, care conţin un domeniu de legare de receptori (receptor-binding domain, RBD) care recunoaşte în mod specific “punctul de ancorare” – un receptor specific de la suprafaţa celulelor organismului. Acest receptor – numit enzima de convertire a angiotensinei 2 (ACE2) este o proteină cu membrană integrală prezentă pe multe celule din organismul uman, cu cea mai puternică manifestare în inimă, sistemul vascular, sistemul gastrointestinal şi rinichi, ca şi în celulele alveolare tip II din plămâni. (Li 2003, Hofmann 2005).

Domeniul de legare al receptorilor (RBD) al virusului SARS-CoV-2, proteina ţepoasă, se leagă de receptorul uman ACE2. Acest mecanism de legare este un factor important în determinarea infecţiozităţii virale şi evoluţia COVID-19. Mai mult, este de asemenea o ţintă majoră pentru dezvoltarea vaccinurilor şi altor tratamente. (Du 2009, Du 2017).

În timp ce căutarea acestor medicamente intervenţionale şi vaccinuri este în desfăşurare, există o cale mult mai directă – şi în special mult mai sigură – de a preveni această interacţiune a coronavirusurilor cu receptorii ACE2: suprimarea manifestării receptorilor ACE2 în celulele organismului uman, astfel încât acestea să nu mai fie disponibile pentru ancorarea coronavirusurilor.

Într-un studiu recent de pionierat, am reuşit să arătăm că o combinaţie specifică de microelemente nutritive care conţine vitamina C, anumite minerale, aminoacizi şi extracte din plante, a fost eficientă în diminuarea semnificativă a manifestării celulare a ACE2 în tipuri de celule cheie ţintite de virus: căile respiratorii mici (alveolare) din plămânii umani, celulele epiteliale  şi celulele endoteliale (vasculare)  ale sistemului vascular uman. Aceste microelemente nutritive au fost deosebit de eficiente în diminuarea manifestării receptorilor ACE2 în condiţii de inflamaţie care este asociată cu infecţia cu coronavirus precum şi cu alte infecţii. (Ivanov 2020).

Rezultatele remarcabile ale acestui studiu au ridicat întrebarea dacă microelementele nutritive ar putea să afecteze şi alte mecanisme esenţiale ale infecţiilor cu coronavirus şi anume legarea virusului de receptorii ACE2. Astfel, am încercat să blocăm intrarea virală în celulele umane – exact acelaşi mecanism al bolii care a fost ales în toate abordările curente privind căutarea vaccinurilor.

Dacă rezultatele acestui studiu ar fi pozitive, o nouă abordare, naturală şi sigură, ar deveni disponibilă omenirii pentru controlul eficient al actualei pandemii.

Astfel, în actualul studiu am testat eficienţa unei alte compoziţii de microelemente nutritive, care conţinea polifenoli şi alte componente din plante, asupra ambelor aspecte cheie ale infecţiozităţii SARS-CoV-2: blocarea manifestării receptorului celular ACE2 şi – în acelaşi timp – blocarea  legării proteinei ţepoase specifice SARS-CoV-2 de receptorii ACE2 din celulele umane.

MATERIALE ŞI METODE

Culturi celulare

Celulele epiteliale ale căilor aeriene mici umane (SAEC, achiziționate de la ATCC) au fost cultivate în mediu de creștere a celulelor epiteliale ale căilor aeriene (ATCC) în baloane de plastic la 37oC și 5% CO2. În experimentele SAEC, pasajul 5-7, au fost acoperite cu plăci de plastic cu 96 de godeuri acoperite cu colagen (Corning) în mediu de creștere de 100 μL și au fost crescute timp de 4-7 zile pentru a ajunge la stratul confluent.

Conbinaţia de microelemente nutritive

Combinația de microelemente nutritive utilizată în experimentele noastre a fost dezvoltată la Institutul de Cercetare Dr. Rath (San Jose, CA). Formularea testată conținea: quercetină – 400 mg, extract de plante crucifere – 400 mg, extract de rădăcină de curcuma – 300 mg, extract de ceai verde (80% polifenoli) – 300 mg, și resveratrol – 50 mg.

Suplimentare celulară

Amestecul de microelemente nutritive a fost dizolvat în HCl 0,1N conform protocolului US Pharmacopeia (USP 2040) și desemnat ca o soluție de stocare. Pentru experimentele de manifestare ACE2, celulele SAEC au fost suplimentate cu dozele indicate ale formulei în mediu de creștere celulară la 100 μl / godeu timp de 3-7 zile. Concentrațiile aplicate de nutrienți au fost exprimate în μg / ml.

Testul ACE-2 ELISA

Godeurile plăcii de cultură au fost spălate de două ori cu soluție salină tamponată cu fosfat (PBS) și fixate cu 3% formaldehidă / 0,5% soluție Triton X100 / PBS timp de 1 oră la 4oC, apoi spălate de patru ori cu PBS. Ulterior, s-au adăugat 200 pl de albumină serică bovină 1% (BSA, Sigma) în PBS și placa a fost incubată la 4oC peste noapte. Anticorpii policlonali anti ACE2 de iepure (Sigma) au fost adăugați la 100 μl 1% BSA / PBS pentru 1,5 ore de incubație la temperatura camerei (RT). După trei cicluri de spălare cu 0,1% BSA / PBS, godeurile au fost furnizate cu 100 pl  anticorpi anti- IgG de iepure conjugați cu peroxidază de hrean (HRP, Sigma) timp de 1 oră la RT. După trei cicluri de spălare cu 0,1% BSA / PBS, activitatea HRP reținută a fost determinată prin incubare cu 100 μl de soluție de substrat TMB (Sigma) timp de 20 de minute la RT, urmată de adăugarea a 50 μl de H2SO4 1N și s-a efectuat măsurarea densității optice la 450 nm cu cititor de plăci micro (dispozitive moleculare). Rezultatele sunt exprimate ca procent de control experimental fără adaos (medie +/- SD, n = 6). Controlul nespecific (godeuri incubate fără anticorpi anti ACE2) valoarea medie (n = 6) a fost scăzută din toate valorile probei.

Blocarea RBD (domeniul de legare a receptorilor)

Această analiză a fost efectuată folosind un kit de testare de neutralizare a virusului surogat GenScript SARS-CoV-2 care poate detecta fie anticorp, fie inhibitori care blochează interacțiunea dintre domeniul de legare a receptorului (RBD) al proteinei virale ţepoase și receptorul ACE2 de la suprafaţa celulei.

Toate probele de testare cu concentrațiile indicate și controalele pozitive și negative (furnizate de producător) au fost diluate cu tamponul de diluare a probei cu un raport de volum de 1: 9. În tuburi separate, RBD conjugat HRP a fost, de asemenea, diluat cu tampon de diluare HRP cu un raport de volum de 1:99.

Reacția de legare / neutralizare a fost efectuată conform protocolului producătorului. Pe scurt, martorii pozitivi și negativi diluați, precum și probele testate cu concentrațiile indicate au fost amestecate cu soluția diluată de HRP-RBD cu un raport de volum de 1: 1 și incubate timp de 30 de minute la 37 ° C. Apoi, 100 pl fiecare din amestecul de control pozitiv, amestecul de control negativ și amestecurile de probă de testare au fost adăugate la godeurile corespunzătoare cu receptor ACE2 imobilizat și incubate timp de 15 minute la 37 ° C. Ulterior, plăcile au fost spălate de patru ori cu 260 pl / godeu din 1 x soluție de spălare și soluție de TMB a fost adăugată la fiecare godeu (100 pl / godeu). Plăcile au fost incubate în întuneric la temperatura camerei timp de până la 5 minute. Apoi, s-au adăugat 50 pl / godeu de soluție stop pentru a stinge reacția și absorbanţa a fost măsurată imediat în cititorul de plăci la 450 nm. Experimentul a fost efectuat de trei ori în duplicate. Datele sunt prezentate ca% din control.

Figura 1:

A. Coronavirusurile infectează celulele organismului uman prin intermediul receptorului ACE2
B. Principiul kitului de testare-cercetare disponibil pe piaţă folosit în acest studiu pentru măsurarea interacţiunii dintre proteina SARS-CoV-2 care se leagă de receptor (RBD) şi receptorul ACE2 de la suprafaţa celulei

REZULTAT

Eficienţa unei combinaţii specifice de microelemente nutritive asupra manifestării ACE2 în celulele epiteliale ale alveolelor umane mici

Figura 1 arată efectul diferitelor concentraţii ale unei combinaţii specifice de extracte şi substanţe active din plante asupra manifestării celulare a receptorilor ACE2 în celulele epiteliale umane ale alveolelor mici.

Figura 2. Efectele combinaţiei de microelemente nutritive asupra manifestării receptorilor ACE2 în celulele pulmonare umane (celule epiteliale alveolare mici) Schimbările în manifestarea ACE2 sunt prezentate ca % control.

Rezultatele indică o scădere a manifestării receptorilor celulari ACE2 în funcţie de concentraţie, evaluată prin legarea unui anticorp specific. La cea mai mare concentraţie a combinaţiei de elemente nutritive de 320 μg/ml manifestarea receptorilor celulari ACE2 a scăzut cu până la 92%. Acest lucru arată că în prezenţa acestor microelemente nutritive legarea virală de aceşti receptori celulari poate fi substanţial redusă.

Efectul unei combinaţii specifice de microelemente nutritive asupra legării RBD de receptorul ACE2

Legarea secvenţei RBD a proteinei ţepoase a SARS-CoV-2 de receptorul său celular este pasul necesar către obţinerea accesului la celulele ţintă pentru infectare virală.

Am testat efectele aceleiaşi combinaţii specifice de componente active din plante asupra blocării interacţiunii acestei secvenţe de legare a receptorilor proteinei ţepoase a SARS-CoV-2 cu receptorul uman ACE2.
În studiul nostru am aplicat un test de screening de înaltă sensibilitate de ultimă generație care poate detecta inhibitori care blochează interacțiunea dintre domeniul de legare a receptorului (RBD) al proteinei virale ţepoas cu receptorul ACE2.

Fig.3 Blocarea legării SARS-CoV-2 (RDB) la receptorul ACE2 prin combinație specifică de micronutrienți în% din control. „Controlul blocării” = 100% inhibare a legării.

Figura 3 arată că această combinație de compuși naturali derivați din plante care a fost testată a reușit să blocheze atașarea domeniului RBD de proteina ţepoasă a virusului SARS-CoV-2 la receptorul său ACE2. Acest efect inhibitor a fost dependent de concentrație și la concentrația de 100 pg / ml a amestecului a provocat o inhibare a legării de 97%. Eficienţa sa puternică în prevenirea legării virale a fost observată deja la o concentrație de 40 de ori mai mică, adică 2,5 µg / ml, ceea ce a cauzat o inhibare a legării de aproximativ 20%.

DISCUŢIE

Semnificaţia descoperirilor noastre

Rezultatele prezentate în acest studiu documentează faptul că microelementele nutritive pot inhiba puternic mecanismele celulare importante asociate infecției cu coronavirus.
Aceste date devin disponibile într-un moment critic în care comunitatea științifică și medicală globală caută cu disperare soluții eficiente la pandemia COVID-19.

Prin aplicarea metodologiilor științifice și a tehnicilor de ultimă generație utilizate în cercetarea coronavirusului, am demonstrat că microelementele nutritive pot inhiba legarea RBD de proteina ţepoasă a SARS-CoV-2 cu receptorul său specific ACE2 cu până la 97%. Aceasta înseamnă că microelementele nutritive ar putea preveni aproape complet infecțiozitatea virală. În plus, aceeași compoziție de microelemente nutritive a inhibat expresia receptorilor ACE2 pe celule epiteliale alveolare mici umane cu până la 92%.

Anterior, am raportat, de asemenea, că o altă combinație de compuși naturali, inclusiv vitamina C, aminoacizi, componente vegetale și minerale, ar putea diminua semnificativ manifestarea receptorilor ACE2 pe două tipuri de celule vizate în principal de coronavirus: epiteliul pulmonar uman și celulele endoteliale vasculare umane (Ivanov 2020).

O altă constatare importantă a acestui studiu a fost că inhibarea manifestării receptorilor ACE2 a fost și mai pronunțată în condițiile pro-inflamatorii care însoțesc orice infecție virală. Acest lucru ar implica faptul că eficienţa microelementelor nutritive ar fi și mai pronunțată în condițiile clinice și în stadiile avansate ale COVID-19, caracterizate prin inflamație generalizată și o așa-numită „furtună de citokine”.

Prezentul studiu indică faptul că formulele specifice din compuși biologic activi derivați din plante pot fi eficiente în controlul simultan a două mecanisme critice implicate în infecţiozitatea coronavirusului.

În lumina descoperirilor noastre, este deosebit de dezamăgitor faptul că eforturile oamenilor de ştiinţă au ignorat până acum în mare măsură numărul mare de dovezi științifice și clinice care confirmă eficienţa microelementelor nutritive  în multe aspecte ale infecțiilor virale. (Jariwalla 2007, Jariwalla 2010, Deryabin 2008, Barbour 2007).

Dovezile conform cărora compușii naturali, cum ar fi microelementele nutritive, ar putea fi răspunsul la pandemia de coronavirus și la alte pandemii, ar trebui să inspire comunitatea științifică și medicală să se angajeze într-un efort global de extindere a cunoștințelor despre valoarea terapeutică a microelementelor nutritive și a altor compuși naturali în prevenirea bolilor infecțioase în general.

Implicaţiile acestor descoperiri pentru politicile de sănătate publică

Amploarea actualei pandemii  și dimensiunea costurilor sale umane și economice fac din documentarea noastră despre valoarea specifică a microelementelor nutritive în controlul acestei pandemii o abordare convingătoare a sănătății publice.

Acest lucru este deosebit de important, deoarece toate celelalte măsuri dezvoltate în prezent sunt fie asociate cu efecte secundare severe, fie sunt strategii noi și netestate. Reacțiile de avertizare ale comunității internaționale la primele vaccinuri înregistrate, care sunt bazate pe gene virale, mărturisesc conștientizarea riscurilor potențiale asociate cu implementarea la nivel de populație a unor astfel de tehnologii.

Pe baza rezultatelor studiului nostru, o abordare bazată pe microelemente nutritive şi dovedită științific devine disponibilă ca o strategie eficientă – și sigură – de sănătate publică pentru combaterea pandemiei actuale. Cu o rată de blocare de aproape 100%, microelementele nutritive rivalizează cu eficienţa oricărui vaccin – însă fără riscuri incalculabile. Mai mult, această abordare extinde potențialele beneficii pentru sănătate prin abordarea altor mecanisme critice asociate  infecțiile cu coronavirus. Aceste mecanisme includ o scădere semnificativă a disponibilității „ancorelor” virale (receptori ACE2) pe suprafața celulelor umane și sprijin esențial pentru funcționarea sistemului imunitar.

O abordare bazată pe microelemente nutritive permite, de asemenea, oamenilor în general să participe activ la prevenirea infecțiilor cu coronavirus – dincolo de purtarea măștilor, distanțarea fizică și alte măsuri de protecţie.

BIBLIOGRAFIE

1. Chakraborty I, Maity COVID-19 outbreak: Migration, effects on society, global environment and prevention. Sci Total Environ. 2020; 728: 138882. https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.scitotenv.2020.138882
2. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/. Updated August 13, Accessed August 14, 2020.
3. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382(8): 727-733. doi: 1056/NEJMoa2001017
4. Li Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu. Rev. Virol. 2016; 3(1): 237-261. doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301
5. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin- converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426(6965): 450–454. https://doi.org/10.1038/nature02145
6. Hofmann H, Pyrc K, van der Hoek L, Geier M, Berkhout B, Pohlmann S. Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(22):7988– 7993. https://doi.org/10.1073/pnas.0409465102
7. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang S. The Spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7, 226–236. https://doi.org/10.1038/nrmicro2090
8. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang. MERS-CoV Spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21(2): 131-143. doi:10.1080/14728222.2017.1271415
9. Ivanov V, Ivanova S, Niedzwiecki A, Rath M. Effective and save global public health strategy to fight the COVID-19 pandemic: Specific micronutrient combination inhibits Coronavirus cell-entry receptor (ACE2) expression. J Cell Med & Nat. Health, 2020.
10. Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
11. Jariwalla R, Gangapurkar B, Pandit A, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Micronutrient Cooperation in Suppression of HIV Production in Chronically and Latently Infected Cells. Mol Med 2010; 3(3): 377-85. doi: 10.3892/mmr_00000268.
12. Deryabin PG, Lvov DK, Botikov AG, et al. Effects of a nutrient mixture on infectious properties of the highly pathogenic strain of avian influenza virus A/H5N1. Biofactors. 2008; 33(2): 85-97. doi: 10.1002/biof.5520330201.
13. Barbour EK, Rayya EG, Shaib H, et al. Alleviation of histopathological effects of avian influenza  virus by a specific nutrient synergy. International J Appl Res Vet Med. 2007; 5(1): 9-16.