Комбинация микроэлементов воздействует на два ключевых этапа проникновения коронавируса (SARS-CoV-2): „стыковку“ вируса с рецептором ACE2 и его клеточная экспрессия

 



A. Гоч, В. Шумера, В. Иванов, А. Недзвецки, М. Рат.

Научно-исследовательский институт доктора Рата, Сан-Хосе, Калифорния.

 


 

Аннотация

Введение

Пандемия коронавируса представляет собой беспрецедентный вызов для человечества и экономик всех стран. Поиск вакцин и других подходов по профилактике и лечению на сегодняшний день сосредоточен на синтетических методах, что, не удивительно, связано с различной степенью неблагоприятных последствий.

Результаты

Здесь мы сообщаем, что определенный состав микроэлементов может практически полностью блокировать стыковку коронавируса с рецептором ACE2. Более того, этот состав микроэлементов смог значительно подавить образование рецептора АСЕ2 в эпителиальных клетках альвеолы (легких) человека более чем на 90%.

Вывод

Данное исследование создает основу для эффективных и безопасных стратегий общественного здравоохранения, основанных на оптимальном потреблении питательных микроэлементов. Оно позволяет людям во всем мире принимать активное участие в профилактике коронавирусных инфекций — помимо ношения масок, социального дистанцирования и других оборонительных мер.

 


 

Введение

Быстрое распространение текущей пандемии коронавируса (COVID-19) угрожает здоровью человечества, ослабляет экономику стран мира и ставит под угрозу процветание будущих поколений (Chakraborty 2020). В первой половине 2020 года COVID-19 затронул более 16 миллионов человек и стал причиной более 660 000 смертей во всем мире (https://covid19.who.int/).

При секвенировании полного генома вируса из образцов пациента (Zhu 2020) был выявлен новый коронавирус-2 — острого респираторного синдрома (SARS-CoV-2), и заболевание, вызванное этим вирусом, было названо коронавирусной болезнью 2019 (COVID-19).

Еще одним важным шагом на пути к сдерживанию распространения этой пандемии стало определение механизма, при помощи которого SARS-CoV-2 заражает клетки человеческого тела. Коронавирусы сначала соединяются со специфическими рецепторами на поверхности клеток. Впоследствии они попадают в клетки и распространяются через транспортные везикулы (эндосомы), в конечном итоге достигая ядра клетки, где их генетический материал включается в ДНК клеток человеческого тела (Li 2016).

Особое значение имеет первый этап инфекционного пути, а именно, соединение (стыковка) вируса с  рецептором на поверхности клетки (рис. 1). Со стороны коронавируса этот механизм соединения включает в себя наличие специфических белков-шипов, закрепленных на поверхности вируса, содержащих рецептор-связывающий домен (RBD), который распознает „место стыковки“ — специфический рецептор на поверхности клеток организма. Этот рецептор — ангиотензин-преобразующий фермент 2 (ACE2) — является интегральным мембранным белком, присутствующим во многих клетках человеческого организма — в сердечно-сосудистой системе, желудочно-кишечном тракте, почках, а также в альвеолярных клетках тип II легких. (Li 2003, Hofmann 2005)

Рецептор-связывающий домен (RBD) SARS-CoV-2 сцепляется с рецептором ACE2 человека. Этот связывающий механизм оказывает значительное влияние на способность вируса инфицировать клетки организма COVID-19 и, поэтому, играет важную роль в разработке вакцин и других терапевтических подходов для борьбы с коронавирусом (Du 2009, Du 2017).

В то время как поиск вакцин продолжается, существует другой эффективный и безопасный способ предотвратить стыковку коронавирусов с рецептором АCE2. Этот способ основан на подавлении образования рецепторов ACE2 — „входных порталов“ для коронавируса.

В недавнем новаторском исследовании нам удалось показать, что особый состав микроэлементов, содержащих витамин С, некоторые минералы, аминокислоты и растительные экстракты, эффективно снижал экспрессию АСЕ2 в ключевых типах клеток, являющихся мишенью коронавируса: эпителиальные клетки малых дыхательных путей (альвеолы), или коротко — эпителиальные клетки легких, а также эндотелиальные клетки кровеносных сосудов человека. Эти питательные микроэлементы были особенно эффективны в подавлении экспрессии рецептора ACE2 при воспалительных процессах, которые связаны с коронавирусом и другими инфекциями (Ivanov 2020).

Результаты этого исследования поставили следующий вопрос — могут ли микронутриенты также влиять на другие механизмы, важные для коронавирусных инфекций, а именно на сцепление вируса с рецептором ACE2. Таким образом, наши эксперименты были направлены на блокирование проникновения вирусов в клетки человека — тот самый механизм, который лёг в основу практически всех исследований, сфокусированных на разработке вакцины.

Если результаты этого исследования будут положительными, человечеству станет доступен новый, естественный и безопасный подход для эффективного контроля над текущей пандемией.

В настоящем исследовании мы проверили эффективность комбинации микронутриентов, содержащей полифенолы и растительные компоненты, в отношении двух ключевых аспектов инфицирования SARS-CoV-2: блокирование образования рецептора ACE2, а также, блокирование процесса соединения специфического белка SARS-CoV-2 с рецептором ACE2 на клетках человека.

 


 

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

 

Клеточные культуры

Эпителиальные клетки малых дыхательных путей человека (далее именуемые SAEC; приобретенные у ATCC — American Type Culture Collection) выращивали в питательной среде (ATCC) в пластиковых  колбах при 37 ° C и 5% CO2. Для эксперимента SAEC, пассаж 5-7, наносили на обработанные коллагеном 96-Well- планшеты (Corning) в питательном растворе объемом 100 μL и выращивали до непрерывного слоя в течение 4-7 дней.

Состав комбинаций микронутриентов

Комбинация микронутриентов, использованная в наших экспериментах, была разработана в Исследовательском институте доктора Рата (Сан-Хосе, Калифорния). Исследуемый состав содержал: кверцетин — 400 мг, экстракт крестоцветных растений — 400 мг, экстракт корня куркумы — 300 мг, экстракт зеленого чая (80% полифенолов) — 300 мг и ресвератрол — 50 мг.

Добавление микронутриентов

Смесь, растворенная в 0,1N HCl в соответствии с протоколом Фармакопеи США (USP 2040), была обозначена как исходный раствор. Для экспериментов клетки обогащали указанными дозами добавок в 100 μL/well питательной клеточной среде в течение 3-7 дней. Применяемые концентрации добавок были даны в миллионных долях от исходной концентрации на мл (мкг / мл).

ACE-2-ELISA-Assay

Емкости с культурами дважды промывались буферизованным фосфатным солевым раствором (PBS) и фиксировались 3% раствором формальдегида / 0,5% Triton X100 / PBS в течение 1 часа при 4°C, а затем четыре раза промывались PBS. Добавляли 200 μl 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA, Sigma) в PBS. Затем планшет инкубировали при 4 ° С в течение ночи. Поликлональные кроличьи анти-АСЕ-2-антитела (Sigma) добавляли к 100 μL 1% BSA/PBS  для полуторачасовой инкубации при комнатной температуре (RT). После трех циклов промывания 0,1% BSA/PBS содержимое смешивали со 100 μl кроличьими анти-IgG-антителами, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP, Sigma), в течение 1 часа при комнатной температуре (RT). После трех циклов промывки 0,1% BSA/PBS определяли сохраненную активность HRP путем инкубации со 100 μl раствора субстрата TMB (Sigma) в течение 20 минут при  комнатной температуре с последующим добавлением 50 μl 1N H2SO4 и измерением оптической плотности при 450 nm с микропланшетным ридером (Molecular  Devices). Результаты выражены в процентах от экспериментального контроля без добавок (среднее +/- SD, n=6). Среднее значение неспецифического контроля (емкости, которые были инкубированы без антитела против ACE2) (n=6) вычитали из всех значений образца.

Блокирование RBD (RBD — рецептор-связывающий домен)

Этот анализ проводился с использованием тестового набора для нейтрализации суррогатного вируса GenScript SARS-CoV-2, который может обнаруживать либо антитела, либо ингибиторы, которые блокируют взаимодействие между рецепторсвязывающим доменом (RBD) и рецептором на поверхности клетки ACE2. Все тестовые образцы с заданными концентрациями, а также положительный и отрицательный контроли (часть тестового набора GenScript) были разбавлены буфером для разведения образцов в объемном соотношении 1: 9. В отдельных пробирках RBD, конъюгированный с HRP, также разбавляли буфером для разведения HRP в объемном соотношении 1:99.

Реакцию связывания / нейтрализации проводили согласно протоколу производителя. В течение короткого времени разбавленные положительный и отрицательный контроли, а также испытуемые образцы с указанными концентрациями смешивали с разбавленным раствором HRP-RBD в объемном соотношении 1: 1 и инкубировали в течение 30 минут при 37 ° C. Затем по 100 мкл каждой смеси — положительного контроля, отрицательного контроля и смеси тестируемых образцов — добавляли в соответствующие лунки с рецептором ACE2 и инкубировали при 37 ° C в течение 15 минут. Затем планшеты промывали (четыре раза 260 мкл / лунку) промывочным раствором и добавляли раствор TMB в каждую лунку (100 мкл / лунку). Планшеты инкубировали в темноте при комнатной температуре до 5 минут. Затем добавляли 50 мкл / лунку исходного раствора, чтобы ослабить реакцию, и сразу же измеряли оптическую плотность в планшет-ридере при 450 нм. Эксперимент проводили трижды в двух экземплярах. Значения даны в% от контроля.

Фигура 1:

A. Коронавирусы проникают в клетки человеческого тела через рецептор ACE2.
B. Принцип коммерчески доступного метода тестирования, который используется в этом исследовании для измерения взаимодействия между рецептор-связывающим белком (RBD) коронавируса (SARS-CoV-2) и рецептором ACE2 на поверхности клеток организма.

 


 

Результаты

Эффективность влияния комбинации микронутриентов на экспрессию рецепторов ACE2 в эпителиальных клетках легких человека.

Эффективность влияния комбинации микронутриентов на экспрессию рецепторов ACE2 в эпителиальных клетках легких человека.

На рис. 2 показано влияние различных концентраций комбинации микронутриентов, растительных веществ и экстрактов на образование (экспрессию) рецепторов ACE2 в эпителиальных клетках малых дыхательных путей человека (альвеолах).

Рис. 2 — влияние различных концентраций комбинации микронутриентов на образование (экспрессию) рецепторов ACE2 в эпителиальных клетках малых дыхательных путей человека (альвеолах). Изменения экспрессии ACE2 представлены в % от контроля.

Результаты теста показывают подавление образования рецепторов АCE2. Эффективность подавления зависит от концентрации комбинации микроэлементов. При максимальной концентрации питательных микроэлементов (320 мкг/мл) экспрессия клеточных рецепторов ACE2 снизилась на 92%. Это указывает на то, что процесс соединения вируса с рецепторами АCE2 может быть значительно подавлен, поскольку эти рецепторы практически не образуются.

Влияние комбинации микронутриентов на соединение вируса с рецептором ACE2

Сцепление рецептор-связывающего домена (RBD) белка SARS-CoV-2 с рецептором ACE2 является необходимым шагом для проникновения вируса в клетку.

Мы исследовали способность комбинации активных растительных соединений подавлять сцепление рецептор-связывающего домена (RBD) белка SARS-CoV-2 с рецептором ACE2. В нашем исследовании мы применили современный высокочувствительный скрининговый тест, который может выявить ингибиторы, блокирующие взаимодействие (сцепление) между рецептор-связывающим доменом (RBD) белка SARS-CoV-2 и рецептором ACE2.

Рис. 3. Эффективность использовании комбинации специфических микронутриентов при блокировании соединения (RDB) SARSCoV-2 с рецептором ACE2 в % от контроля. «Контроль» — 100% подавление соединения.

На рис. 3 показано, что тестируемая комбинация способна блокировать процесс прикрепление домена RBD белка SARS-CoV-2 к рецептору ACE2. Ингибирующий эффект — зависимый от концентрации микронутриентов — составлял 97 % при концентрации смеси 100 мкг/мл. Эффективность комбинации наблюдалась и при значительно более низкой концентрации микронутриентов — 2,5 мкг / мл — и составляла 20 %

 


 

ДИСКУССИЯ

Важность наших выводов

Результаты, представленные в этом исследовании, подтверждают, что микронутриенты могут в значительной степени влиять на важные клеточные механизмы, связанные с коронавирусной инфекцией.

Эти данные становятся доступными в решающий момент, когда мировое научное и медицинское сообщество отчаянно ищет эффективные решения проблемы пандемии COVID-19. Применяя современные научные методы и технологии, используемые при исследованиях, мы показали, что микронутриенты могут на 97% подавлять процесс стыковки рецептор-связывающего домена (RBD) с рецептором ACE2.  Это означает, что микроэлементы могут почти полностью предотвратить вирусную инфекцию. Кроме того, тот же самый микроэлементный состав подавлял образование рецепторов АCE2 на эпителиальных клетках человека до 92%.

Ранее мы также сообщали, что еще одна комбинация природных соединений, включающая витамин С, аминокислоты, растительные компоненты и минералы, может значительно снизить экспрессию рецепторов АСЕ2 у двух типов клеток, которые преимущественно атакуются коронавирусом — эпителиальные клетки легких и эндотелиальные клетки сердечно-сосудистой системы человека (Ivanov 2020)

Другим важным выводом этого исследования было то, что торможение процесса образования рецепторов АСЕ2 было еще более выраженным при воспалительных состояниях, сопровождающих любую вирусную инфекцию. Это означает, что эффективность питательных микроэлементов также высока в клинических условиях и на поздних стадиях COVID-19, характеризующихся генерализованным воспалением и так называемым „цитокиновым штормом“.

Настоящее исследование показывает, что специфические комбинации биологически активных соединений растительного происхождения могут быть эффективны при контроле сразу двух критических механизмов, которые определяют способность коронавируса вызывать инфекцию. Учитывая данные результаты, особенно разочаровывает тот факт, что научным сообществом в значительной степени игнорируется масса научных и клинических данных, подтверждающих эффективность микронутриентов при инфекционных заболеваниях (Jariwalla 2007, Jariwalla 2010, Deryabin 2008, Barbour 2007). Доказательства того, что микроэлементы могут стать ответом на коронавирусную и другие пандемии, должны побудить ученых и медицинских работников во всем мире стремиться к получению новых знаний о терапевтической ценности микроэлементов при профилактике инфекционных заболеваний.

Значение этих результатов для политики общественного здравоохранения

Масштабы нынешней пандемии и ее воздействие на здоровье людей, а также на экономику, делают наши исследования в области питательных микроэлементов важнейшим вкладом в борьбу с этой пандемией. Это особенно важно, поскольку другие методы, которые разрабатываются в настоящее время, либо имеют значительные побочные эффекты, либо представляют собой новые и непроверенные терапевтические подходы. Настороженная реакция международного сообщества на первые зарегистрированные вакцины, в основе которых лежат гены вируса, свидетельствует об осознании потенциальных рисков, связанных с внедрением таких технологий в масштабах всего населения. Наши исследования представляют собой научно подтвержденный подход использования питательных микроэлементов как эффективную и безопасную стратегию борьбы с текущей пандемией.

При уровне блокировки почти 100% микроэлементы ни в коей мере не уступают по эффективности ни одной из концепций вакцины, притом не несут в себе неисчислимых рисков. Кроме того, этот подход имеет другие ключевые преимущества с точки зрения борьбы с коронавирусными инфекциями, такие как значительное уменьшение рецепторов ACE2 на поверхности клеток человека и общее усиление иммунной системы. Подход на основе микронутриентов также позволяет всему населению активно участвовать в профилактике коронавирусных инфекций. Таким образом, эта основанная на микронутриентах стратегия выходит далеко за рамки ношения масок, социального дистанцирования и других пассивных мер.

 


 

ССЫЛКИ

 

  1. Chakraborty I, Maity COVID-19 outbreak: Migration, effects on society, global environment and prevention. Sci Total Environ. 2020; 728: 138882. https://dx.doi.org/10.1016%2Fj.scitotenv.2020.138882
  2. WHO Coronavirus Disease (COVID-19) Dashboard. https://covid19.who.int/. Updated August 13, Accessed August 14, 2020.
  3. Zhu N, Zhang D, Wang W, et al. A novel coronavirus from patients with pneumonia in China, 2019. N. Engl. J. Med. 2020; 382(8): 727-733. doi: 1056/NEJMoa2001017
  4. Li Structure, Function, and Evolution of Coronavirus Spike Proteins. Annu. Rev. Virol. 2016; 3(1): 237-261. doi:10.1146/annurev-virology-110615-042301
  5. Li W, Moore MJ, Vasilieva N, et al. Angiotensin- converting enzyme 2 is a functional receptor for the SARS coronavirus. Nature. 2003; 426(6965): 450–454. https://doi.org/10.1038/nature02145
  6. Hofmann H, Pyrc K, van der Hoek L, Geier M, Berkhout B, Pohlmann S. Human coronavirus NL63 employs the severe acute respiratory syndrome coronavirus receptor for cellular entry. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2005; 102(22):7988– 7993. https://doi.org/10.1073/pnas.0409465102
  7. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang S. The Spike protein of SARS-CoV—A target for vaccine and therapeutic. Nat. Rev. Microbiol. 2009; 7, 226–236. https://doi.org/10.1038/nrmicro2090
  8. Du L, He Y, Zhou Y, Liu S, Zheng BJ, Jiang. MERS-CoV Spike protein: a key target for antivirals. Expert Opin Ther Targets. 2017; 21(2): 131-143. doi:10.1080/14728222.2017.1271415
  9. Ivanov V, Ivanova S, Niedzwiecki A, Rath M. Effective and save global public health strategy to fight the COVID-19 pandemic: Specific micronutrient combination inhibits Coronavirus cell-entry receptor (ACE2) expression. J Cell Med & Nat. Health, 2020.
  10. Jariwalla RJ, Roomi MW, Gangapurkar B, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Suppression of influenza A virus nuclear antigen production and neuraminidase activity by a nutrient mixture containing ascorbic acid, green tea extract and amino acids. 2007; 31(1): 1-15. doi: 10.1002/biof.5520310101
  11. Jariwalla R, Gangapurkar B, Pandit A, Kalinovsky T, Niedzwiecki A, Rath M. Micronutrient Cooperation in Suppression of HIV Production in Chronically and Latently Infected Cells. Mol Med 2010; 3(3): 377-85. doi: 10.3892/mmr_00000268.
  12. Deryabin PG, Lvov DK, Botikov AG, et al. Effects of a nutrient mixture on infectious properties of the highly pathogenic strain of avian influenza virus A/H5N1. Biofactors. 2008; 33(2): 85-97. doi: 10.1002/biof.5520330201.
  13. Barbour EK, Rayya EG, Shaib H, et al. Alleviation of histopathological effects of avian influenza  virus by a specific nutrient synergy. International J Appl Res Vet Med. 2007; 5(1): 9-16.


Источник:

https://www.jcmnh.org/micronutrient-combination-inhibits-two-key-steps-of-coronavirus-sars-cov-2-infection-viral-binding-to-ace2-receptor-and-its-cellular-expression/